研究表明,标准质粒DNA有三种基本结构:超螺旋(Supercoiled,简称SC),线性(Linear)和开环(opencircular,简称OC),这三种颗粒各有各种聚合形态(或称为聚合形态(或称为聚合形态)oligomericforms,multimerformation或concatemer等。
超螺旋被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达的质粒形式。在基因治疗和基因治疗中DNA在疫苗研究中,对药用质粒的超螺旋含量有明确要求(FDA:>80%,NMPA:≥90%,SMPA:>85%)。
检测超螺旋颗粒的方法有很多,如琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis,简称AGE),毛细管凝胶电泳(Capillarygelelectrophoresis,简称CGE)和HPLC(质粒提及检测通则,GB/T40170-2021)。AGE它是一种应用广泛、速度快、对实验条件要求低的分析方法。
质粒经AGE在分析中,不同类型的相同颗粒具有不同的电泳迁移率,即电泳后看到的不同条带。然而,大量的实验表明,超螺旋二聚体通常与开环单体混合,因此仅通过单个质粒电泳图定性和定量不同的条带是不准确的。
为此Azenta建立了一套高效的超螺旋颗粒AGE分析方法:使用具有特殊功能的核酸酶(具有双链酶)DNA特异核酸外切酶活性和单链DNA核酸内切酶活性可降解基因组、线性和开环质粒,但不能降解超螺旋双链DNA)处理质粒时,开环和线性带会被消化,只留下超螺旋带。与未处理的质粒相比,可以简单快速地判断超螺旋带的位置和比例,即定性定量质粒中超螺旋结构的质粒。