2022/09/30 / 公司活动及新闻
质粒DNA的不同构型对转化效率的影响
质粒DNA的不同构型对转化效率的影响
2022/09/30
我们讨论了三种常见的质粒在电泳中。超螺旋结构和酶切割后的线性结构基本确定,但质粒在第三条带(质粒反复冻融后大量出现)中的结构一直存在争议。现在假设它的结构是质粒二聚体,那么这三种结构都是质粒,它们的转化效率是一样的吗?好奇的小编先在网页上搜索。有人说线性质粒的转化效率是超螺旋环形质粒的1/100。他认为领导说要通过实验得出结论。为了验证实验,小编制定了以下实验。
试验准备:
质粒样本:新鲜提取的质粒样本:pUC-19以及-20℃储存在冰箱中并多次使用pUC-19(主条带为质粒二聚体)。
实验材料:DH5α感受态细胞(SimgenCat.No.8301010).疑胶DNA回收试剂盒(SimgenCat.No.2001050).Amp抗性平板.1.5ml离心管.EcoRI内切酶。
实验设备:台式少量离心机.电泳仪.恒温培养箱.少量紫外分光光度计.移液器等。
实验内容:
1.使用疑胶DNA回收试剂盒回收酶切割产品和质粒二聚体,用少量紫外分光光度计测量浓度。使用无菌超纯水分别提取新鲜质粒.酶切产物.二聚体稀释至0.1ng/μl和1ng/μl;
2.将-80℃存放的DH5α感觉态细胞在冰箱上融化,根据感觉态细胞说明书转换三种不同构型的颗粒,如下表所示,
3.将转换后的感觉态细胞涂抹在Amp平板上,37℃培养恒温箱过夜,观察转换结果。
从左到右,照片分别是线性粒质.质粒二聚体.超螺旋颗粒,从上到下为1ng.0.1ng,从上图结果来看,超螺旋质粒无疑是转化率最高的,线性质粒的转化率最低,约为超螺旋质粒的1/20,质粒二聚体的转化率为0.1ng与超螺旋质粒的对比不是很明显,在1ng时转化率约为超螺旋质粒的1/3。
感觉态细胞的原理没有明确的说法。接受度最高的是通过处理增加细胞的渗透性,促进细胞膜表面的一些孔,促进外源性基因或媒介进入感觉态细胞。
如果这个理论是正确的,那么这些孔自然有一定的尺寸,所以进入细胞的效率可能是不同的主要原因:我们比较这三种不同形状的粒子DNA,超螺旋结构的颗粒整体尺寸最小,最容易进入细胞;线性颗粒结构不如超螺旋紧凑,可能卡在细胞膜外,不能进入细胞,属于残留颗粒,自然效率最低;对于二聚体质颗粒DNA,虽然体积大,进入细胞的效率降低,但质粒结构仍然完整,因此转化效率介于线性质粒和超螺旋质粒之间。
至少,我们的实验证明,线性粒子仍然可以进行转化实验,但我们不知道线性粒子成功转化的真正原因。也许线性粒子通过细胞内酶的装饰(如重新连接)产生完整的粒子。