质粒具有稳定可靠、操作简单的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)而且结构简单，质粒任何其他载体。原则上，克隆质粒载体非常简单。首先，用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后在体外连接两者，然后通过获得的重组质粒转化细菌来完成。但工作中，如何区分插入有外源DNA重组质粒和自身环化的载体分子很难不插入。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA浓度比可以在一定程度上限制载体本身的环化，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略，如载体去磷酸化，以最大限度地减少载体本身的环化，也可以使用遗传手段，如α重组子和非重组子的互补现象等。

外源DNA片段与质粒载体的连接反应策略如下：

1.用两种不同的限制性内切酶消化带有非互补突出端的片段，可以产生非互补粘性末端，这也是最容易克隆的DNA一般情况下，常用的质粒载体由多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点组成，因此几乎总能找到外源DNA限制酶切位点的载体在片段末端匹配，从而将外源片段定向克隆到载体上。也可以在PCR扩增时，在DNA在片段两端人工添加不同的酶切位点，以便与载体连接。

2.用相同的酶或同尾酶处理用相同的酶或同尾酶处理。由于质粒载体也必须用相同的酶消化，并获得相同的两个相同的粘度末端，外源片段和质粒载体在连接反应中DNA本身可以环化或几个分子串联形成寡聚物，可能有正反两个连接方向。因此，必须仔细调整连接反应中的两种DNA浓度，使正确连接的产品数量达到最高水平。载体也可以DNA用碱性磷酸酯酶去除5'磷酸基团，最大限度地抑制质粒DNA自我环化。带5'端磷酸的外源DNA片段能有效地与去磷酸化载体连接，产生两个缺口的开环分子E.coli缺口可以在受体菌扩张过程中自动修复。