RNA影响（RNAinterference,RNAi）指双链在进化过程中的高度保守RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发，同源mRNA高效特异性降解。小影响RNA（S**llinterferingRNA；siRNA）有时被称为短影响RNA（shortinterferingRNA）或沉默RNA（silencingRNA），它是一个双股，长20到25个核苷酸RNA，生物学中有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参加RNA影响（RNAi）现象是以专一的形式调整基因的表达RNAi过程1确定目标基因2设计siRNA基因抑制的有效性在很大程度上取决于目的基因序列的选择。可以随机选择目的序列，也可以通过的基因的不同区域选择不同的序列，以确定哪个序列最有效。1.从转录本（mRNA）的AUG开始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记录其3'端19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。这19个碱基用于正义链和反义链(不包括AA重复)设计。2.避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。3.SiRNA序列的GC含量应为30%-50%。4.不要针对5'和3'端非编码区域（untranslatedregions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调节蛋白组合区域，这些地方有丰富的调节蛋白组合区域UTR结合蛋白或翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合物mRNA进而影响siRNA的效果。5.在公共数据库中比较所选序列，以确保目的序列与其他基因不同源。6.选择合适的生成目标序列。通常，一个基因需要设计多个目标序列siRNA，找到最有效的siRNA序列。7.负比较：一个完整的siRNA试验应该有负比较，作为负比较siRNA应选择siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。一般做法是选择siRNA如果顺序混乱，还应检查结果，以确保其与其他基因不同源。3得到siRNA产品0.目前，将采用实验人员siRNA分子导入细胞的方法RNAi的研究。现在有五种产品siRNA分子方法和方法。前三种方法都是在体外获得的siRNA分子后，采用转染、电转化等方法直接使用siRNA导入哺乳动物细胞；后两种方法与媒介和siRNA表达框为媒介，使siRNA细胞内表达分子。这两种方法的优点是不需要直接操作RNA。1.化学合成。siRNA纯度高，不需要任何其他测试，但缺点是价格昂贵，定制时间长。因此，研究人员更多地使用相对便宜的方法siRNA在确认高效率时进行筛选siRNA然后，再利用化学合成法生成siRNA进行试验。体外转录是一种廉价的方法。最适用：找到了最有效的siRNA需要大量的情况siRNA研究不适用：选择siRNA长期研究的主要原因是价格因素2。体外转录0siRNA对应序列生成DNA链，再利用RNA体外转录聚合酶，转录产物可导入细胞。1.1优点是成本低，质量高，毒性低，稳定性好(与化学合成相比)1.2转录siRNAs化学合成较低，就可以实现化学合成siRNAs高浓度(10:1).但是，缺点是需要进行其他测试，并且siRNA限制生成量。2.2此外，与化学合成相比，它仍然需要占用研究人员大量的时间——毕竟，化学合成只需要订购。它最适用于：选择siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，当化学合成的价格成为障碍时。不适用：测试需要大量，一个特定的siRNA。长期研究。3.“鸡尾酒”法（RNaseIII酶切dsRNA）。其他制备siRNA需要设计和检测多种方法的缺陷siRNA为了找到一个有效的顺序siRNA。使用这种方法——制备混合物有很多种siRNAs“混和鸡尾酒”这个缺陷是可以避免的。这种方法一般选用200-1000碱基mRNA模板，长片段双链是通过体外转录的方法制备的dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在体外消化，获得很多siRNAs“混和鸡尾酒”。因为siRNA有许多不同的混合物siRNAs，一般能保证有效抑制目的基因。优点是能够绕过检测和有效选择siRNA为研究人员节省时间和金钱的顺序步骤（注：一般使用）RNAseIII一般比用Dicer要便宜）。缺陷也很明显，有可能导致非特异性基因沉默，特别是同源或密切相关的基因。现在大多数研究表明，这种情况通常不会产生影响。不适用于：快速、经济地研究基因功能缺失的表型：长期研究项目，或需要特定的研究项目siRNA研究，特别是基因治疗4.质粒，介导病毒载体siRNA体内表达。前三种方法的缺点：siRNA进入细胞后很容易降解siRNA不受控制的总数。体外生成siRNA基因抑制持久性一般只有5-7天，最长也只有14天。需要连续导入siRNA，不能一劳永逸，相对麻烦。思路：将siRNA对应的DNA位于媒体中的双链序列复制，位于RNA聚合酶III启动子后，它可以在体内表达所需的siRNA这种分子方法的优点是siRNA直接从体内获体内获得的RNAi长期研究的唯一方法。介质上的抗性标记(嘌呤霉素、新霉素、潮霉素)有助于快速筛选出阳性复制品.最适用：已知有效siRNA序列需要长时间保持基因沉默，或者用抗生素来表达siRNA的细胞。长期研究。不适用：选择siRNA序列(其实主要是指费时繁琐的工作，比如多次复制和测序)5.siRNA表达框介导siRNA体内表达。siRNA表达框的本质是能够表达的siRNA分子的PCR产品可以导入细胞来抑制特定基因的表达，而无需复制介质。siRNA表达框介导siRNA表达也属于体内表达的方法siRNA不同的表达媒介，SECs不需要媒体复制、测序等耗时的步骤，可以直接从PCR不需要一天时间就要一天的时间。SECs变成挑选siRNA最有效的工具甚至可以在特定的研究系统中选择siRNA最合适的搭配！若是在PCR在两侧添加酶切位点，然后通过SECs选择最有效的siRNA之后，可以直接复制到媒体中构建siRNA表达载体。可以的媒体可以用来顺利表达siRNA研究长效抑制。这种方法的主要缺点是PCR产品很难转染到细胞中。如果有合适的新型转染试剂，可以改进SEC这个问题可以通过转染效率来解决。此外，没有复制到媒体中的PCR片段不适合大规模制备。最适合：选择siRNA在复制到媒体之前，选择最佳启动子并不适合：长期抑制研究。(如果复制到媒体)4siRNA1.磷酸钙共沉淀2。电穿孔法3.DEAE-葡聚糖4。机械法5。正离子脂质体试剂0。注意事项1。siRNA应在转染前确定siRNA大小和纯度。获得高纯度siRNA，建议通过15-20%丙烯酰胺胶洗脱或去除反应中多余的核苷酸、小寡核苷酸、蛋白质和盐离子。注：化学合成RNA经常需要跑胶电泳净化(也就是说)PAGE胶提纯）。2.防止RNA酶污染少量RNA酶将导致siRNA实验失败。因为在实验环境中RNA酶很常见，如皮肤、头发、所有徒手接触或暴露在空气中的物体等，以确保实验的每一步都不受影响RNA酶污染非常重要。3.健康的细胞培养物质和严格的操作保证了转染的重复性，健康的细胞转染效率更高。此外，较低的传代数可以保证每次实验所用细胞的稳定性。为了改善实验，建议使用50代以内的转染细胞，否则细胞转染效率会随着时间的推移而显著降低。4.避免使用抗生素Ambion公司建议从细胞种植到转染后72小时避免使用抗生素。抗生素会在通过的细胞中积累毒素。在某些细胞和转染试剂中，siRNA转染时需要无血清条件。在这种情况下，可以同时使用正常的培养液和无血清培养基进行对比实验，以达到最佳的转染效果。5.选择合适的转染试剂siRNA不同类型的制备方法和靶细胞，选择好的转染试剂和优化操作siRNA实验的成功尤为重要。6.通过适当的阳性对照来改善大多数细胞的转染和检测条件，门基因是更好的阳性对照。对比不同浓度的阳性siRNA转向靶细胞(同样适合实验靶靶细胞）siRNA），统计对比蛋白或转染48小时mRNA与未转染细胞的减少相比。太多的siRNA会导致细胞毒性甚至死亡。7.通过标记siRNA提高实验莹光标记siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA在跟踪转染过程中，引入了细胞定位和双标记实验(配合标记抗体)siRNA细胞，将转染与靶蛋白表达的下降相结合。5RNAi实时荧光定量效果检验PCR化学原理包括探针类和非探针类——探针类使用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加——非探针类使用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增。前者更具特异性，但后者简单易行，因为它增加了探针的识别步骤。